ExpreS2ion Biotech Holding har en mycket stor potential i sitt joint venture AdaptVac

2017-10-27 09:49

Ann-Cathrin Engwall, PhD i mokylärbiologi med immunologi och virologi som specialiteter, har gjort följande analys av ExpreS2ion Biotech Holdings joint venture AdaptVacs teknologiplattform som har en mycket stor potential att konkurrera för utveckling av nya billigare terapeutiska och vanliga vacciner inom både infektionssjukdomar och cancer.

Det som omedelbart väcker mitt vetenskapliga intresse när jag ombeds titta närmare på företagets inriktning är den plattform av viruslika partiklar (VLPs) som man har tillgång till i sitt joint venture AdaptVac och som kan användas i olika typer av vacciner för att presentera antigener. Systemet lämpar sig både för infektionspreventiva ändamål liksom för terapeutiska då man visat i studier att man med sin vaccinstrategi lyckats bryta perifer B-cellstolerans i möss och fått immunsvar mot kroppsegna proteiner. Att bryta tolerans har visat sig vara en mycket stor utmaning för många företag som utvecklar immunterapier. Plattformen inbjuder därför till samarbeten med läkemedelsbolag som har intressanta målproteiner men som inte lyckas pga att de inte har hittat en effektiv och tolererbar immuniseringsmetod.

VLPs är partiklar som liknar virus och som precis som dessa har formats spontant av strukturella virusproteiner men som till skillnad mot virus saknar förmågan att föröka sig i värdceller. Precis som virus så aktiverar VLPs immunsystemet mer effektivt än om man enbart administrerar antigena peptider eller proteiner i lösning. Immunogeniciteten av ett antigen är beroende av den tredimensionella strukturen. När en peptid exponeras på en yta som påminner i formen om ett virus som VLPs gör så känns det bättre igen av immunsystemet som ett klassiskt hot och kroppen reagerar därför mer effektivt på utmaningen genom att aktivera de immunologiska systemets komplexa mekanismer mer som ett virus eller en bakterie skulle göra. Vårt immunsystem registrerar olika egenskaper hos en patogen tidigt i processen för att kunna orkestrera ett adekvat immunsvar för den aktuella typen av utmaning. Ett isolerat virusprotein i lösning ger en annan typ av immunsvar än vi skulle få om vi exponerades för det intakta viruset. Det innebär att om man vaccinerat med ett lösligt protein så får man inte ett lika effektivt, långvarigt och brett skydd som om man blivit smittad med viruset. VLPs är också lika små som vanliga virus dvs ca 20-200 nm i storlek och definieras som s k nanopartiklar vilket gör att de lättare kan tas upp i celler även om detta inte sker aktivt via virala adsorptionsmekanismer som hos många infektiösa virus. Det finns redan idag flera vaccinprodukter på marknaden som använder sig av VLPs för antigenpresentation bl a Gardasil från Merck, Engerix och Cervarix från GSK samt Hecolin från Xiamen Innovax.

Många VLP-system som finns på marknaden idag har en del svagheter. Dessa bygger på att de antigener man vill exponera binds direkt till de strukturella elementen i den artificiella viruskapsiden eller skalet. Detta kan man antigen åstadkomma genom en genetisk fusion av DNA innan man producerar beståndsdelarna till VLP eller genom kovalent bindning till den fullständiga VLP via kemiska reaktioner i efterhand. När man i det första fallet jobbar med fusionsgener så innebär det ofta en risk att strukturen av inblandade proteiner ändras pga av steriska hinder dvs platsbrist i rymden. Det kan leda till att VLP-formationerna inte blir stabila eftersom byggstenarna inte längre passar ihop lika bra i bygger den viruslika capsiden eftersom antigendelarna är i vägen. För att hitta en optimal kombination för varje nytt VLP-projekt krävs därför ett stort mått av tidskrävande ”trial and error” försök med olika tänkbara kombinationer. Det andra fallet med kovalent bindning av antigener till VLP-capsiden innebär att de antigena beståndsdelarna påverkas kemiskt vilket kan innebära att de förändrar form och att epitoper inte exponeras naturligt och därmed är mindre immunogena eller skapar ett ospecifikt immunsvar. Dessutom är de kemiska modifieringsmetoderna inte alltid så effektiva vilket leder till att densiteten av presenterade antigen på ytan blir lägre i jämförelse med den genetiska approachen vilket kan vara en nackdel eftersom det finns en kritisk gräns för förekomsten av antigener för att sparka igång ett immunsvar.

ExpreS2ion Biotechs joint-venture AdaptVac har ett VLP-system, spy-VLP, som utnyttjar alla fördelarna med VLPs men där man tillfört ett smart och flexibelt system för att lätt kunna konjugera olika typer av antigen på cellytan inkluderat polyklonala peptidmixar. Metoden för att fästa antigen på VLP bygger på ett naturligt system som man har identifierat i bakterien Streptococcus pyogenes. Det handlar om en spontan, snabb, mycket stabil och irreversibel isopeptidbindning som sker mellan aminosyrorna Lys och Asp. De båda enheterna som binder till varandra utgörs dels av en peptid, SpyTag som är 13 aminosyror lång och en större proteinenhet SpyCatcher som är 116 aminosyror lång. De genetiska anlagen för dessa båda enheter har var för sig genetiskt fuserats till de genetiska anlagen som kodar för de strukturella enheter som bildar skalet till bakteriofagen, Acinetobacter phage AP205 (SpyTag-VLP, SpyCatcher-VLP). Antigenerna kan sedan förses med motsvarande spy-enhet för att kunna bindas till dessa spy-modifierade VLPs. Bakteriofager är virus som infekterar bakterier och som därför är lite annorlunda uppbyggda än de virus som infekterar människan. Fördelen med att använda beståndsdelar från just denna bakteriofag för att bilda VLPs är att båda ändarna av proteinet hamnar på ytan av VLP vilket är orsaken till att toleransen för fusioner i både C- och N-ändarna med andra molekyler t ex SpyTag eller SpyCatcher är stor eftersom det i mindre utsträckning påverkar själva strukturen och stabiliteten av VLPs. Förutom VLP-system till vilka man kopplat SpyTag respektive SpyCatcher till N-terminalen så har man ett tredje system som har en SpyTag kopplat till både C- och N-terminalerna för att i praktiken kunna binda in dubbelt så många antigener (2xSpyTag-VLP).

När man karaktäriserade och undersökte sina olika spyVLPs testade man dem i kombination med flera olika typer av vaccinkandidater som varierade både i härkomst, struktur och storlek. En slutsats man kunde dra var att ju större antigenmolekylerna var desto färre av dessa kunde bindas in på varje VLP. För SpyTag-VLP såg man en tydlig minskning av inbindningsfrekvensen från 75 % av ner till 50% för antigenstorlekar över ca 50 kDa. Som mest kunde man binda in nästan 200 molekyler dvs antigen på varje VLP i genomsnitt. I det fallet handlade det om 2xSpyTag-VLP med ca 54 % inbindning av SpyCatcher - IL-5. Ungefär 140 molekyler av samma antigen band till varje SpyTag-VLP motsvarade 77% inbindningsfrekvens. Antalet antigener man kan binda in begränsas alltså främst av den yta som finns tillgänglig inte av antalet bindningsställen på spy-VLPs.

För att kunna studera effektparametrar av spy-VLPs så valde man att koppla på och immunisera möss med ett par kliniskt relevanta malariaantigen, Pfs25 respektive VAR2CSA. Dessa båda spy-VLP-vacciner har jämförts med kontrollvaccin där man har blandat omodifierade AP205 VLPs och fria antigen. I dessa studier visade det sig att vaccination med spy-VLP-vaccinerna gav upphov till högre serumkoncerntrationer av IgG-antikroppar jämfört med kontrollvaccin. Detta trots att man i ett av fallen, VAR2CSA, inte använt något adjuvans eller immunstimulerare vid immuniseringen vilket är en stor fördel. För det andra malariaantigenet, Pfs25, där man använde det klassiska vaccinadjuvanset Alhydrogel som innehåller aluminiumhydroxid fick man dessutom en liten förskjutning mot ett Th1-svar jämfört med kontrollen. Ett Th1-svar är framför allt inriktat på att med mördarceller eliminera kroppsceller som utgör ett hot, som infekterade celler eller cancerceller. Det senare är intressant eftersom man använt ett adjuvans som normalt styr immunsvaret starkt emot Th2. Pfs25 är betydligt mindre än VAR2CSA antigenet, 40 kDa resp 118 kDa, och varje VLP exponerar nästan dubbelt så många antigen per spy-VLP, 109 mot 61 st i genomsnitt. Kanske spelar detta en roll för att just Pfs25 får denna effekt med ett visst Th1-svar. Den dominerade IgG-antikroppen var dock IgG1 i samtliga fall vilket innebär ett dominerande Th2-svar. De möss som fått de antigenkonjugerade spy-VLPs hade också genererat IgG-antikroppar som band bättre till antigenet (högre aviditet) i jämförelse med kontrollerna med fria antigen i lösning.

För att vaccinet skall vara användbart måste även antikropparna ha avsedd biologisk effekt in vivo. Pfs25 är ett protein som uttrycks på malariaparasitens form, ookinete, som är ett stadie som existerar under parasitens reprodutionsprocess i myggan när en hanlig och en honlig könscell smälter samman. Man kan betrakta ookineten ungefär som ett befruktat ägg innan det inplanteras i livmoderslemhinnan. Ookineten borrar sig sedan in i myggans tarmvägg där de utvecklas till oocyter som slutligen brister och släpper ut runt 1000 sporozoiter som tar sig till myggans salivkörtlar och som därefter kan infektera människan via myggans saliv. För att visa biologisk effekt studerades om blodserum från de spy-VLP-Pfs25-vaccinerade mössen kunde hämma malariaparasitutvecklingen efter att man matat malariamyggor med serumet. I dessa försök lyckades man blockera omvandlingen från ookinet till oocyt med 100 % i de myggor som fått i sig den högsta koncentrationen av IgG 750 ug/ml. Även serum med lägre IgG-koncentrationer 83,3 ug/ml kunde blockera omvandlingen med 96%.

Pregnant-Associated–Malaria (PAM) orsakas av parasiten Plasmodium falciparum och är ett livshotande tillstånd både för den gravida kvinnan och för fostret. Malariainfekterade röda blodkroppar kan binda till moderkakan hos gravida kvinnor via parasitgenererade membranproteiner på blodkropparnas yta. VAR2CSA är en unik del av ett sådant membranprotein (PfEMP1) som binder till chondroitinsulfat i placentan dvs moderkakan. Gravida har normalt sett ett nedtryckt immunsvar för att skydda fostret från att stötas bort och skadas av mammans immunförsvar är gravida kvinnor extra mottagliga för infektioner bl a från Plasmodium falciparum som orsakar denna svåra form av malaria. Förekomsten av parasiter i placentan hos den gravida leder succesivt till blodbrist och svullnad av organet. Mindre blod och därmed mindre näring och syre kan därmed transporteras via placentan till fostret vilket påverkar tillväxten av fostret och kan orsaka fosterskador samt missfall. I detta fall jämförde man in-vitro serum från de möss som vaccinerats med VAR2CSA-spy-VLP respektive de som fått kontrollvaccinet med fritt okopplat VAR2CSA-antigen och hur de kunde förhindra bindningen mellan infekterade röda blodkroppar och chondroitinsulfat. Det man kunde konstatera var att serum från möss vaccinerade med VAR2CSA-spy-VLP kunde blockera bindningen ca åtta gånger effektivare än kontrollvaccinet. Detta visar att man kan uppnå en betydligt bättre biologisk effekt om man immuniserar med vacciner där man kopplat antigenerna till en viruslik struktur som spy-VLPs än om man bara sprutar in dem fria i en lösning.

Slutligen så vill jag adressera den potential för vaccinplattformen där jag tror att tekniken skulle kunna få stort genomslag, nämligen inom terapeutiska vacciner t ex för cancerbehandling. Ett stort problem inom detta område är att lyckas bryta immunologisk tolerans med hjälp av de tekniker som finns tillgängliga. Tidigt under utvecklingen av vårt immunsystem sker en selektion där immunceller som kan bindas till kroppsegna proteiner inaktiveras eller stimuleras till att begå självmord. Detta för att immunsystemet inte skall bryta ner våra egna vävnader och organ. Under vissa förutsättningar tex vid infektioner eller vaccinationer kan immunsystemet luras att attackera egna vävnader och celler i kroppen. Detta är tillstånd som vi kallar för autoimmuna sjukdomar. Diabetes, reumatism, psoriasis och myastenia gravis är exempel på sådana autoimmuna sjukdomar. Även cancerförändrade eller skadade celler kan kännas igen som främmande och aktivera immunförsvaret som attackerar och eliminerar de skadliga cellerna. Många försök som gjorts har misslyckats pga att man inte får något specifikt immunsvar eller för att man upptäckt oacceptabla biverkningar ofta pga nya typer av adjuvans. I detta fall har man testat spy-VLP-vacciner riktade mot tre olika kroppsegna proteiner, PD-L1, CTLA-4 och IL-5. De två första proteinerna nedreglerar immunsvaret och är kopplade till sämre prognos för cancerpatienter medan blockering av IL-5 har visat sig vara en intressant terapi för behandling av svår astma. I dessa försök gav spy-VLP-vaccinerna signifikant högre nivåer av antikroppar riktade mot kroppsegna proteiner. En intressant observation var att den vaccinvariant med fler antigenmolekyler IL-5 kopplade till 2xSpyTag VLP (193) gav upphov till markant högre IgG-nivåer än när samma IL-5-antigen kopplats till SpyTag VLP med färre molekyler på ytan (134). Slutsatsen jag drar är att det bästa immunsvaret får man med mindre och fler antigen kopplade till samma VLP.

Det finns sammanfattningsvis flera betydelsefulla fördelar med den antigenpresenterande vaccinplattformen spy-VLP jämfört med att vaccinera med antigener i en lösning:

1.    Det är billigare och mer förutsägbart att tillverka både spy-VLPs och spy-fusionsantigen.

2.    Det är enkelt att binda upp ett stort antal antigen stabilt på spy-VLPs utan att det påverka stabiliteten av vaccinet.

3.    Det finns en stor flexibilitet för att binda in olika typer av antigen med olika ursprung, struktur och storlek. Dock fungerar mindre antigen bättre då fler antigenmolekyler kan bindas till varje spy-VLP vilket ökar densiteten av epitoper och ger upphov till högre IgG-antikroppsnivåer efter vaccinering.

4.    Antigener som är kopplade på spy-VLPs är effektivare immunstimulerare än antigener i lösning och kan t o m aktivera immunsvar utan adjuvans.

5.    Presentation via spy-VLP ger upphov till mer specifika IgG-antikroppar som binder hårdare till sin målmolekyl (högre aviditet) sannolikt beroende på att antigenet presenteras från en viruslik yta och epitoperna därmed får en mer naturlig 3D-struktur.

6.    Man har visat en biologisk effektivitet för spy-VLP-vaccin riktat mot kliniskt relevanta målmolekyler för malariabehandling, och 18 oktober kom ett pressmeddelande om att man även har lyckats visa proof-of-concept i en bröstcancermodell med trangena möss med spy-VLP-vaccin riktat mot HER2.

7.    Spy-VLPs med många antigenmolekyler kopplade (ca 200 st) visar en signifikant förstärkning av Th1-profilen jämfört med fritt antigen i lösning trots immunisering i närvaro av ett Th2-drivande adjuvans.

8.    Man har lyckats bryta perifer B-cellstolerans med hjälp spy-VLP-vacciner som har gett upphov till antikroppar riktade mot flera olika kroppsegna proteiner i möss. Detta är en metod som sannolikt ger upphov till mindre biverkningar än de nya typerna av adjuvans som tex Montanide.

9.    Det är möjligt att koppla flera olika antigen på samma spy-VLP vilket skulle kunna ge en bättre och bredare effekt.

10.  Det borde också finnas tekniska möjligheter att koppla på olika målsökande peptider på VPL-vaccinet för att specifikt nå vissa typer av celler i kroppen. Detta är en klar fördel speciellt i olika former av terapeutiska applikationer.

Sammanfattningsvis ser jag en mycket stor och bred potential i ExpreS2ion Biotechs joint venture AdaptVac tack vare dess spyVLP-baserade vaccinutvecklingsplattform inom både terapeutiska och vanliga vacciner med många möjliga immunologiska tillämpningar inom infektionssjukdomar, cancer m m."

Ann-Cathrin Engwall (född Svensson) har fyra akademiska examina i naturvetenskap och medicin nämligen farmaci, fil kand i medicinsk bioteknologi, MSc i bioteknologi och PhD i molekylär cellbiologi med inriktning immunologi och virologi. Hon har erfarenhet från bl a forskning om antigenpresentation, blodhjärnbarriären, virusforskning, cancerforskning, läkemedels- och vaccinutveckling i bioteknikindustrin, utveckling av biofarmaceutiska tillverkningsprocesser och som inbjuden forskare på ansedda tyska Paul Erlich Institute som ungefär motsvarar svenska läkemedelsverket och smittskyddsinstitutet sammanslagna.